Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (Trihidroximetilaminometaneto) é uma base fraca com pKa de 8,1 a temperatura ambiente de 25°C e um intervalo de amortecimento eficaz de pH 7,0 ~ 9.2O pH da solução aquosa de Tris alcalino é de cerca de 10.5O ácido clorídrico é geralmente adicionado para ajustar o valor de pH ao valor desejado, de modo a que se possa obter o amortecedor deste valor de pH.O ADN será desprotonado numa solução deste tipo., melhorando assim a sua solubilidade. Se a solução ácida ajustada para o pH for substituída por ácido acético, obtém-se um "tampão TAE" (Tris/Acetato/EDTA),enquanto um "tampão TBE" (Tris/Borato/EDTA) é obtido pela substituição por ácido bóricoEstes dois tampões são comumente utilizados em experimentos de eletroforese de ácidos nucleicos. TAE, TBE, etc., preparados pela Tris, são os reagentes mais comumente utilizados para eletroforese de DNA, e TE (pH 8.0) é utilizado principalmente para dissolver o ADN.(TE é uma combinação de Tris e EDTA.) 1MTris-HCl6.8 e 1.5MTris-HCl8.8 são os reagentes mais comumente utilizados para SDS-PAGE.

Reagente TRIS

Entre as operações convencionais de engenharia genética, a eletroforese por gel de agarose é a mais utilizada.Identificação e purificação de fragmentos de ADN. Geralmente usa um dispositivo de eletroforese horizontal para eletroforese sob um campo elétrico com intensidade e direção constantes.As moléculas de DNA são carregadas negativamente em tampões de gel (geralmente alcalinos) e migram de eletrodos negativos para positivos em um campo elétricoA taxa de migração das moléculas de ADN depende do tamanho e da conformação da molécula.etc..

Operaçãoprocesso:

1 tampão TE: (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA)

Reservatório de eletroforese (50XTAE)

2 tampão de eletroforese (50XTAE): Tris 242g, ácido acético glacial 57,1 ml, EDTA (0,5 mol/ L pH 8,0) 100 ml

Diluir 50 vezes com água destilada quando utilizado.

3 tampão da amostra (6X): azul bromofenol 0,25%, azul xileno 0,25%, sacarose 40% (W/V)

4 tampão STET (pH 8,0) (8% sacarose, 0,5% Tritão, 50 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris)

1) Medir 100 ml de solução de eletroforese TAE, adicionar 0,7 g de agarose, misturar bem, colocar no forno a microondas, aquecer durante 3 minutos, dissolver completamente a agarose.

2) Fechar a placa eletroforética limpa e seca com borracha esterilizada e selar a borda com uma pequena quantidade de solução de agarose.Coloque o pente e ajustar a distância entre a borda inferior do pente e a placa de eletroforese, geralmente 1-2 mm é apropriado.

3) Quando a solução de agarose dissolvida for resfriada a cerca de 50 °C, adicionar 5 M L de brometo de etidio e a concentração final de brometo de etidio é de 1,0 m g/m L. Após mistura,derramar a solução de agarose na placa de eletroforese e mantê-la imóvel sem se mover.

4) Após o gel ter solidificado completamente (30-45 minutos à temperatura ambiente), retire suavemente o pente, retire a fita e coloque o gel na almofada de eletroforese.

5) No processo de eletroforese, foi adicionada solução de eletroforese (1'TAE) para cobrir a superfície do gel de agarose com cerca de 1-2 mm de solução de eletroforese.