Triglicerídeos (TG) são um componente importante dos lipídios sanguíneos, e seus níveis de concentração são indicadores-chave para avaliar o risco de doenças cardiovasculares. Por muitos anos, a detecção clínica de triglicerídeos tem se baseado principalmente em kits de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Uma das enzimas centrais neste método, glicerol quinase (GK), é responsável por catalisar a geração de glicerol-3-fosfato a partir do glicerol, iniciando uma série de reações enzimáticas e, em última análise, determinando o teor de TG através da fotometria. No entanto, as fontes naturais tradicionais de glicerol quinase são frequentemente acompanhadas por enzimas interferentes, como NADH oxidase e catalase, que podem consumir substratos de reação ou produzir reações colaterais, resultando em grandes desvios e baixa reprodutibilidade dos resultados da detecção. Diante dos pontos problemáticos desta indústria, a glicerol quinase recombinante surgiu, levando os testes clínicos a uma nova era de precisão com suas características de alta pureza e baixa interferência.
1, Problema da enzima interferente: o "assassino invisível" da detecção tradicional
No processo de ensaio de imunoabsorção enzimática para detectar triglicerídeos, a glicerol quinase precisa trabalhar em sinergia com a glicerofosfato oxidase, peroxidase e outras enzimas para produzir substâncias cromogênicas através da reação de Trinder. No entanto, se a preparação de glicerol quinase contiver NADH oxidase, ela degradará de forma não específica o NADH (coenzima I reduzida), resultando em uma diminuição da absorbância; Se a catalase estiver presente, ela decomporá o peróxido de hidrogênio gerado na reação, reduzindo a intensidade da cor. A presença dessas duas enzimas interferentes pode causar desvio da curva padrão em casos leves e invalidar completamente os resultados da detecção em casos graves. As fontes naturais de glicerol quinases (como as extraídas de bactérias ou fungos) são frequentemente difíceis de remover completamente devido aos seus complexos processos de extração e dificuldades de purificação, tornando-se um gargalo que limita a precisão da detecção.
2, Tecnologia recombinante: purificando da fonte e criando 'enzimas puras'
A descoberta da tecnologia de DNA recombinante trouxe mudanças revolucionárias para a produção de glicerol quinases. Ao introduzir o gene da glicerol quinase em bactérias de engenharia, como Escherichia coli, e otimizar as condições de expressão, a glicerol quinase recombinante pode alcançar uma expressão eficiente e controlável. Mais importante, o sistema de produção recombinante evita a coexistência de múltiplas enzimas em cepas naturais, e os subsequentes processos de purificação de precisão, como cromatografia e ultrafiltração, podem remover efetivamente componentes interferentes, como NADH oxidase e catalase. A pureza da glicerol quinase recombinante é superior a 95%, o que é muito maior do que a das preparações enzimáticas naturais, cortando o caminho da contaminação por enzimas interferentes da fonte.
3, Melhoria da Estabilidade: Resposta Científica às Questões de Sensibilidade à Temperatura
Embora a glicerol quinase recombinante tenha vantagens significativas em termos de pureza, sua estabilidade em ambientes acima de 45 ℃ é baixa, o que já foi um dos obstáculos à sua ampla aplicação. Através de modificações de engenharia de proteínas, como mutagênese direcionada ao sítio e design racional, os pesquisadores melhoraram com sucesso a estabilidade térmica das enzimas. Ao mesmo tempo, a otimização do sistema tampão e da combinação de agentes protetores na formulação (prestando atenção para evitar os efeitos negativos da trealose) estendeu ainda mais o tempo de armazenamento e a duração de uso da atividade enzimática. Hoje em dia, a glicerol quinase recombinante de alta qualidade pode manter a atividade por um longo tempo a 4 ℃ e funcionar de forma robusta em condições de detecção em temperatura ambiente, atendendo totalmente aos requisitos de armazenamento e operação do kit de reagente.
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