Interferência potencial e estratégias de mitigação do HEPES no desenvolvimento da cor do indicador vermelho de fenol

Em culturas celulares e experiências biológicas,Reservatório HEPESO primeiro é usado para manter a estabilidade do pH no meio de cultura, enquanto o segundo é usado para exibir visualmente as alterações do pH.a interação entre os dois em termos de propriedades químicas pode levar a anormalidades de corEste artigo irá analisar as causas deste fenômeno e fornecer soluções de otimização simplificadas.

Base química da interferência de cor

O vermelho fenólico é um corante sensível ao pH que muda de cor com a acidez ou a alcalinidade: aparece amarelo em ambientes ácidos (pH < 6,8), vermelho em ambientes neutros (pH ≈ 7,4),e vermelho-púrpura em ambientes alcalinos (pH> 8.2) Esta característica torna-o um instrumento ideal para a monitorização do pH dos meios de cultura celular.

A função principal do HEPES como amortecedor é estabilizar o pH liberando ou absorvendo íons hidrogênio.O problema é que os grupos de ácido sulfónico nas moléculas de HEPES têm uma estrutura química semelhante ao fenol vermelho, e quando a concentração de HEPES é elevada, eles vão interagir com o fenol vermelho para mudar a sua estrutura molecular.Esta mudança faz com que a cor do vermelho do fenol se torne mais clara ou mude em um pH específico, por exemplo, pode aparecer de vermelho laranja em vez de vermelho padrão a pH 7.4.

A manifestação intuitiva do fenômeno de interferência

Na cultura de células convencional, se forem utilizadas simultaneamente altas concentrações de HEPES (como mais de 20 mmol/L) e vermelho fenólico, a cor do meio de cultura pode ser mais clara ou amarelada do que o esperado..Por exemplo, o meio de cultura de pH 7,4, que deveria ter sido exibido em vermelho, pode ter-se tornado laranja pálido devido à interferência do HEPES, levando os investigadores a julgarem erroneamente o valor do pH.

Na observação por microscopia de fluorescência, esta interferência é mais pronunciada.resultando em diminuição do brilho da imagem ou aumento do ruído de fundoEste efeito é particularmente proeminente na observação a longo prazo ou em experimentos de imagem de células vivas, que podem mascarar o verdadeiro estado das células.

Plano de otimização simplificado

Ajustar a concentração de HEPES

1- Cultivo convencional: Controle a concentração de HEPES dentro de 10-15 mmol/L, o que tem interferência mínima no desenvolvimento da cor do vermelho fenólico e pode efetivamente manter a estabilidade do pH.

2Experimento de curta duração: se o tempo experimental for curto (por exemplo, < 4 horas), a concentração de HEPES pode ser ainda reduzida para 5 mmol/L, ou somente adicionada quando necessário.

3Células sensíveis: Para as células que são extremamente sensíveis às alterações do pH (como os neurónios), recomenda- se utilizar um sistema tampão de bicarbonato em vez de HEPES ou remover completamente o vermelho do fenólio.

Métodos alternativos de renderização de cores

1Mediante de cultura livre de fenol vermelho: Para experimentos que exijam altas concentrações de HEPES, pode ser selecionado um meio de cultura sem fenol vermelho.e tiras de ensaio de pH ou medidores eletrónicos de pH podem ser utilizados para monitorizar a acidez e a alcalinidade.

2. sondas fluorescentes: Usando corantes fluorescentes como BCECF-AM em vez de vermelho fenol, estas sondas não são afetadas pela interferência HEPES e podem fornecer medições de pH mais precisas.

3Correcção de cor: Se HEPES e vermelho fenol tiverem de ser utilizados simultaneamente, pode ser preparada antecipadamente uma curva padrão para corrigir o desvio de cor observado através do método colorimétrico.

Optimização do projeto experimental

1. Buffering em estágios: utilizar HEPES para manter o pH durante a fase de pré-cultura de células e mudar para um meio de cultura sem HEPES antes da imagem para reduzir a interferência.

2. Selecção de comprimento de onda: na imagem de fluorescência,evitar o comprimento de onda principal de absorção do vermelho fenol (como 560nm) e escolher um canal de fluorescência de comprimento de onda mais longo (como 633nm) para reduzir a interferência de fundo.

3Configuração de controlo: para cada experimento foi criado um grupo de controlo sem HEPES para comparar visualmente as diferenças de cor.

Compreendendo o mecanismo de interação entre HEPES e fenol vermelho,Os pesquisadores podem facilmente ajustar as condições experimentais para garantir a confiabilidade dos resultados do desenvolvimento da cor, mantendo a estabilidade do sistema de culturaPara experimentos complexos, recomenda-se realizar primeiro pré-experimentos em pequena escala para verificar a eficácia do esquema de otimização.

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