No uso deo novo reagente do Trinder TODB, o fundo alto é um problema comum que afeta os resultados de detecção, enquanto a vedação insuficiente e a lavagem incompleta dos pratos são fatores-chave que são facilmente negligenciados durante a operação.Estes dois problemas podem causar um aumento anormal do fundo de cor devido à ligação não específica e interferência de substâncias residuaisAbaixo está uma análise detalhada e uma solução.
Fechamento inadequado: força motriz "nos bastidores" das combinações não específicas
A função da etapa de bloqueio é bloquear os locais não ligantes na superfície do transportador de reação (como uma placa de ensaio de imunossorbente ligada à enzima).Os substratos, conjugados enzimáticos e outros componentes do reagente TODB adsorvem-se aleatoriamente na superfície do suporte, formando um sinal de cor sem a participação da substância-alvo,aumentando diretamente o valor de fundo.
Razão específica
1- Tempo de vedação insuficiente: em geral, a vedação requer a colocação a 37 °C durante 60 minutos ou a temperatura ambiente durante 120 minutos.Os locais ativos na superfície do suporte não podem ser completamente cobertos pela solução de bloqueio (como BSA), leite em pó desnatado), e as áreas hidrofóbicas que não estão bloqueadas adsorvem ativamente os componentes proteicos no sistema de reação TODB, resultando em coloração de fundo.
2. concentração demasiado baixa da solução bloqueadora: quando os ingredientes eficazes da solução bloqueadora são insuficientes, por exemplo, quando a concentração original de 5% BSA cai para 1%,não se pode formar uma película protetora apertada entre as moléculasOs componentes como a peroxidase do rabanete em reagente TODB aderirão à parede interna do poro da placa através de interações hidrofóbicas,e ocorrerão reacções não específicas com o substrato durante a reação.
3- Falha da solução de vedação: se a solução de vedação for congelada e derretida repetidamente, ou conservada durante mais tempo do que a data de validade,Os componentes proteicos no interior vão deteriorar e perder a sua função de vedação, resultando em muitos locais "expostos" na superfície do portador, que se tornam a fonte de sinais de fundo.
Lavagem incompleta de placas: o "efeito de empilhamento" das substâncias residuais
A principal função da lavagem dos pratos é a de remover reagentes livres não ligados (como anticorpos não ligados, substâncias precursoras do TODB).As substâncias residuais continuarão a participar no desenvolvimento da cor nas reações subsequentes., permitindo que a interferência de fundo se acumule.
Razão específica
1. Poucas lavagens de pratos: os testes convencionais exigem a lavagem da placa 3-5 vezes. Se for reduzida a menos de 2 vezes, os complexos de enzimas livres residuais no poço não podem ser completamente removidos,e a reação irá reagir com o substrato TODB, resultando em desenvolvimento de cor adicional.
2. Demasiado resíduo de detergente: Após a lavagem do quadro, se os furos não forem invertidos no papel absorvente e secados, haverá mais resíduo de detergente em cada buraco,e alguns componentes no interior vão perturbar o equilíbrio do sistema de reação TODBAo mesmo tempo, os conjugados enzimáticos residuais irão difundir-se nos furos adjacentes com o líquido, causando contaminação cruzada e elevando o fundo.
3- Há um problema com a máquina de lavar: quando a agulha da máquina de lavar está bloqueada ou a pressão é insuficiente,os cantos dos buracos das placas se tornarão áreas que não podem ser lavadasO reagente TODB residual cristalizará após a secagem e participará da reação quando novamente dissolvido, fazendo com que a cor de fundo local escureça.
Resumo: Detalhes operacionais determinam a eficácia do controlo de fundo
Embora a vedação e a lavagem das placas sejam passos de rotina, a sua qualidade afecta directamente o nível de fundo dos reagentes TODB.Recomenda-se a adoção do método "prolongar o tempo de vedação+aumentar o número de lavagens de pratos", combinado com medidas como a verificação da concentração da solução de vedação e a calibração regular da máquina de lavar roupa,que podem reduzir significativamente o valor de fundo e garantir a precisão dos resultados da detecção.
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